MicroED/3DED

连续电子衍射断层成像，微晶电子衍射（MicroED），或三维电子衍射（3DED）是一项功能强大的结构生物学和材料科学表征手段，它结合了透射电子显微镜（TEM）和电子衍射，揭示纳米尺度晶体在原子尺度上的结构。在这一方法中，一束经过精细聚焦的电子束在连续旋转的样品上从微小的晶体（＜500 nm）采集衍射花样，从而确定晶体的三维结构。

MicroED/3DED 的主要优势

MicroED/3DED 的一大主要优势是它适用于由于受到晶体尺寸限制而难以或无法使用传统 x射线晶体学方法分析的样品。我们可以在更小尺寸的晶体（＜500 nm）上进行 MicroED/3DED 表征，这一尺寸即使在具有挑战的样品，诸如膜蛋白中也相对容易达到。尽管同步辐射x射线自由电子激光（XFELs）也可用在小晶体上（＞500 nm），但需要大量的小晶体，有时需要的数量可能达到数百或数千，才能够确定单个蛋白或者小分子的结构，从而使得这一方法冗长而昂贵。与之相比，MicroED/3DED 仅需要很少数量的小尺寸晶体，就能带来快速和高分辨率的分析。

MicroED/3DED 工作流程

1. 晶体生长：制备薄晶体样品。晶体厚度应当 ＜500 nm 且对电子束透明。
2. 制备载网：将晶体样品转移至 TEM 载网上。

注意：依据样品的不同，晶体生长和载网制备的方法可能有很大差异；在某些情况下，也可能需要冷冻技术。

3. 筛样和数据采集：甄选具有优良衍射特性的单个薄晶体，进而在晶体对电子束曝光的过程中通过样品台的旋转以连续的视频方式采集 MicroED/3DED 数据。
4. 数据可视化：从连续旋转衍射数据中提取并可视化每一帧，保障晶体的良好衍射特性。

注意：针对自动化的或高通量 MicroED/3DED 数据采集，可使用 Latitude^® D 软件。

5. 处理数据：通过成熟的 x射线软件来提取、标定、积分和标定每一帧来自连续旋转衍射的 MicroED/3DED 采集数据。
6. 构建结构：许多软件包，例如 Coot，Phenix 或 SHELX，可被用于结构求解和精修。这一过程涉及到将原子模型拟合到来自衍射数据的电子密度分布中。

MicroED 和直接探测电子计数相机

样品对辐照诱导损伤的敏感度限制了您在采集 MicroED/3DED 数据时所能使用的电子剂量，因此凸显了电子计数直接探测相机的重要性。电子计数消除了信号读出噪音和由电子散射带来的信号波动，显著提高了信噪比（SNR）以及所有空间频率上的探测量子效率。因此保障了衍射斑强度测量的精确度，尤其是高频和低强度的斑点，带来低电子剂量下的高分辨率结构确定。 

您可在 Gatan 目前所有的能量过滤器前/能量过滤器后的相机上进行 MicroED/3DED 采集，包括基于闪烁体光纤耦合的相机（OneView®，ClearView®，以及 Rio®），以及直接探测电子计数相机（K3®，Alpine®，Metro®，以及 Stela®*）。使用 Gatan 的直接探测电子计数相机进行 MicroED/3DED 数据采集时不一定需要中心束挡针（从而提高衍射聚焦和数据处理的有效性）。并能够在衍射成像中以显著更低的背景噪声和高信噪比记录强度跨越若干数量级的布拉格强度（在极低剂量条件下实现高分辨率结构确定）。

*Stela 使用了 DECTRIS 混合像素技术。